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【CEM】自動(dòng)化正交脫保護(hù)Glu(OAllyl)及通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行肽環(huán)化

 更新時(shí)間:2024-10-10 點(diǎn)擊量:102
一、摘要

在Liberty BlueTM自動(dòng)化微波肽合成儀上,可以輕松進(jìn)行Glu(OAllyl)的正交脫保護(hù)和通過內(nèi)酰胺化實(shí)現(xiàn)的肽環(huán)化。成功合成了HIV-1抗體表位gp41659-671和Afamelanotide的分支及內(nèi)酰胺環(huán)化變體。四種肽的純度均在80%到87%之間,每次合成僅需3到3.5小時(shí),且僅產(chǎn)生700到750 mL的總廢物。


二、引言

肽鏈側(cè)鏈官能團(tuán)化技術(shù),如生物偶聯(lián)、分支和環(huán)化,是藥物開發(fā)、醫(yī)學(xué)成像、材料研究等領(lǐng)域中不可或缶夬的重要工具。1-4許多氨基酸殘基都可以作為側(cè)鏈官能團(tuán)化的位點(diǎn),其中就包括谷氨酸。


為了順利實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈官能團(tuán)化,必須為相關(guān)殘基配備適當(dāng)?shù)恼槐Wo(hù)基,該保護(hù)基能夠在肽鏈其余部分不受影響的情況下容易地進(jìn)行選擇性脫保護(hù)。對(duì)于谷氨酸,常用的保護(hù)基是烯丙酯(OAllyl),其脫保護(hù)過程需要催化量的Pd(0)和苯基硅烷參與。

圖1: Fmoc-Glu(OAllyl)-OH


為了展示Liberty Blue自動(dòng)化肽合成儀高效合成和官能化肽鏈的能力,我們合成了HIV-1抗體表位gp41659-671(ELLELDKWASLWN)和Afamelanotide(Ac-SYSNleEHDFRWGKPV-NH2)的分支型和內(nèi)酰胺環(huán)化變體。對(duì)于分支型變體,我們將H-Ala-OtBu與正交脫保護(hù)的Glu側(cè)鏈進(jìn)行偶聯(lián)。而對(duì)于環(huán)化變體,我們?cè)诰€性合成過程中引入了Lys(Alloc),并在進(jìn)行內(nèi)酰胺環(huán)化之前,同時(shí)對(duì)其進(jìn)行脫保護(hù)。


三、材料與方法

試劑

Fmoc-Glu(OAllyl)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-D-Phe-OH 以及 H-Ala-OtBu • HCl(使用前為游離態(tài))均購自 Novabiochem-MilliporeSigma(馬薩諸塞州伯靈頓)。其他氨基酸均購自 CEM Corporation(北卡羅來納州馬修斯),并包含以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán):Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Arg(Pbf)、Glu(OtBu)、His(Boc)、Lys(Boc)、Ser(tBu) 和 Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM Corporation(北卡羅來納州馬修斯)。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)和羥基苯并三唑(HOBt)購自 CreoSalus(肯塔基州路易斯維爾)。哌啶購自 Alfa Aesar(馬薩諸塞州沃德希爾)。苯基硅烷、四(三苯基膦)合鈀(0)、乙酸酐、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-二氧雜辛烷-1,8-二硫醇(DODT)、三異丙基硅烷(TIS)和乙酸均購自 Sigma-Aldrich(密蘇里州圣路易斯)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙酉迷(Et2O)均購自 VWR(賓夕法尼亞州西切斯特)。高效液相色譜(HPLC)級(jí)水(H2O)和高效液相色譜(HPLC)級(jí)乙腈(MeCN)均購自 Fisher Scientific(馬薩諸塞州沃爾瑟姆)。

肽鏈的合成采用0.1 mmol規(guī)模,使用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀在0.556克Rink Amide ProTide LL樹脂(0.18 meq/g取代度)上進(jìn)行。脫保護(hù)反應(yīng)使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用5倍過量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。Alloc脫保護(hù)反應(yīng)使用0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.50 M苯基硅烷在DCM中進(jìn)行。通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行肽鏈環(huán)化反應(yīng),使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液進(jìn)行。切割反應(yīng)使用CEM RazorTM高通量肽切割系統(tǒng),采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例進(jìn)行。切割后,將肽鏈在Et2O中沉淀并過夜凍干。

注意:這些Alloc脫保護(hù)方法所需的鈀量比下一節(jié)所述方法少,但加熱時(shí)間更長(zhǎng)。

肽鏈的合成采用0.1 mmol規(guī)模,使用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀在0.556克Rink Amide ProTide LL樹脂(0.18 meq/g取代度)上進(jìn)行。脫保護(hù)反應(yīng)使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用5倍過量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。5Alloc脫保護(hù)反應(yīng)使用0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.750 M苯基硅烷在DCM中進(jìn)行。通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行肽鏈環(huán)化反應(yīng),使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液進(jìn)行。N端乙?;磻?yīng)使用10%乙酸酐在DMF中進(jìn)行。切割反應(yīng)使用CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng),采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例進(jìn)行。切割后,將肽鏈在Et2O中沉淀并過夜凍干。

注意:這些Alloc脫保護(hù)方法所需的鈀當(dāng)量比前一節(jié)所述方法多,但加熱時(shí)間較短。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為Glu(OAllyl)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。

注意:在Glu(OAllyl)引入后,必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理,以防止因焦谷氨酸形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。


Glu(OAllyl)脫保護(hù):6

用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),然后用DCM洗滌(4 x 4 mL)。接著,向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液(3 mL)。等待90秒后,向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液(1 mL),并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽(4 x 4 mL)。重復(fù)此步驟兩次。完成后,進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作(4 mL),并用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。


側(cè)鏈偶聯(lián):

向反應(yīng)容器中加入氨基酸(H-Ala-OtBu, 2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),并在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器,并加入額外的氨基酸(H-Ala-OtBu, 2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL)。在90℃下再微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。

注意:在Glu(OAllyl)引入后,必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理,以防止因焦谷氨酸形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。


同時(shí)Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脫保護(hù):6


用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),然后用DCM洗滌(4 x 4 mL)。接著,向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液(3 mL)。等待90秒后,向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液(2 mL),并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽(4 x 4 mL)。重復(fù)此步驟兩次。完成后,進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作(4 mL),并用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。


通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化:

將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液(8 mL)加入反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟重復(fù)兩次。完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為Glu(OAllyl)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。

注意:在Glu(OAllyl)引入后,必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理,以防止因焦谷氨酸形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。


Glu(OAllyl)脫保護(hù):6

用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),然后用DCM洗滌(4 x 4 mL)。接著,向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液(2 mL)。等待90秒后,向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液(8 mL),并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽(4 x 4 mL)。重復(fù)此步驟一次。完成后,進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作(4 mL),并用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。


側(cè)鏈偶聯(lián):

向反應(yīng)容器中加入氨基酸(H-Ala-OtBu, 2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器,并加入額外的氨基酸(H-Ala-OtBu, 2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL)。溶液再次在90℃下微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


N-末端乙?;?sup style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important; font-size: 12px;">7

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液(4 mL),在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作(4 mL)。用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為肽的切割準(zhǔn)備。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。

注意:在Glu(OAllyl)引入后,必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理,以防止因焦谷氨酸形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。


同時(shí)進(jìn)行Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脫保護(hù):6

用DMF(4 x 4 mL)洗滌肽,然后用DCM(4 x 4 mL)洗滌。接著,向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液(2 mL)。等待90秒后,向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液(8 mL),并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并用DCM(4 x 4 mL)洗滌肽。此步驟再重復(fù)一次。完成后,進(jìn)行兩次洗滌操作(4 mL),并用DMF(4 x 4 mL)洗滌肽,為通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。


通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化:

將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液(8 mL)加入反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟再重復(fù)兩次。完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


肽鏈與氨基酸偶聯(lián):

將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入氨基酸(2.5 mL)、DIC(1 mL)和Oxyma Pure(0.5 mL),在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器,為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。


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將脫保護(hù)液(4 mL)加入含有肽的反應(yīng)容器中,并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后,用DMF洗滌肽(4 x 4 mL)。然后,向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液(4 mL),在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后,排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作(4 mL)。用DMF洗滌肽(4 x 4 mL),為肽的切割準(zhǔn)備。


四、肽分析

使用配備PDA檢測(cè)器的Waters Acqity UPLC系統(tǒng)對(duì)肽進(jìn)行分析,該系統(tǒng)配有一根Acquity UPLC BEH C8色譜柱(1.7微米,2.1 x 100毫米)。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。峰分析在Waters MassLynx軟件上完成。分離通過梯度洗脫進(jìn)行,流動(dòng)相為0.1% TFA在(i) H2O和(ii) MeCN中。


五、結(jié)果

在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上,通過微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS)制備的Glu分支型HIV-1抗體表位gp41659–671的目標(biāo)肽純度為82%(圖2)。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上,通過微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS)制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型HIV-1抗體表位gp41659–671的目標(biāo)肽純度為87%(圖3)。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上,通過微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS)制備的Glu分支型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為85%(圖4)。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上,通過微波增強(qiáng)的固相肽合成(SPPS)制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為80%(圖5)。


圖2:Glu分支型HIV-1抗體表位gp41659–671的UPLC色譜圖

圖3:內(nèi)酰胺環(huán)化型HIV-1抗體表位gp41659–671的UPLC色譜圖

圖4:Glu分支型阿法美拉肽的UPLC色譜圖

圖5:內(nèi)酰胺環(huán)化型阿法美拉肽的UPLC色譜圖


五、結(jié)果

Liberty Blue自動(dòng)化肽合成儀能夠簡(jiǎn)便高效地合成各種功能化的肽。通過執(zhí)行自動(dòng)化正交脫保護(hù)(及其相關(guān)的合成操作),我們合成了HIV-1抗體表位gp41659–671和阿法美拉肽的分支型和內(nèi)酰胺環(huán)化型變體。這四種肽的純度在80%到87%之間,每個(gè)合成過程需要3到3.5小時(shí),每次合成只產(chǎn)生700到750 mL的總廢物。


六、引用

(1) Krall, N.; da Cruz, F. P.; Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Nat. Chem.2016, 8, 103–113.

(2) Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Chem. Rev. 2015, 115, 2174–2195.

(3) Nielsen, D. S.; Shepherd, N. E.; Xu, W.; Lucke, A. J.; Stoermer, M. J.Fairlie, D. P. Chem. Rev. 2017, 117, 8094–8128.

(4) Wynn, J. E.; Zhang, W.; Falkinham, III, J. O.; Santos, W. L. ACS Med.Chem. Lett. 2017, 8, 820–823

(5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature."

(6) Automated Alloc-deprotection adapted from: Wilson, K. R.; Sedberry,S.; Pescatore, R.; Vinton, D.; Love, B.; Ballard, S.; Wham, B. C.;Hutchison, S. K.; Williamson, E. J. J. Pep. Sci. 2016, 22, 622–627.

(7) CEM Application Note (AP0114) - “Automated N-Terminal Acetylation."

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